Chassériau nació en El Limón, Samaná. Su padre fue Bénoit Chassériau, un francés que desempeñaba un cargo administrativo en lo que entonces era una colonia francesa, y su madre, hija de un terrateniente criollo.
La familia se trasladó a París en 1821 cuando tenía tres años. Desde joven, este artista del pincel mostró una precoz habilidad a la hora de dibujar, por lo que fue aceptado sin titubeos a los 11 años en el taller del reconocido artista Jean Auguste Dominique Ingres en 1830. Allí se convirtió en uno de los alumnos favoritos del gran clasicista. Ingres rápidamente le consideró su discípulo más verdadero, declarando: «Vengan, caballeros, a ver a este niño que será el Napoleón de la pintura».
A los 16 años, Chassériau estableció su propio taller, especializándose como retratista, muy influenciado por el realismo de los cuadros nórdicos, el dramatismo de la pintura española y la técnica de su maestro.
En sus obras se destacan los retratos de modelos familiares: sus autorretratos, los cuadros de su madre, sus hermanas, Adela y Aline, y su hermano Ernest. Una de sus primeras obras fue un retrato a su madre, María Magdalena, lo que en la familia se conocía como «El Gran Cuadro».
Una de las originalidades de Chassériau es la comprensión instintiva y profunda de lo exótico. Sus viajes al Africa francesa no han hecho más que confirmar esa disposición natural en él. A esto se le puede agregar que esa facultad de captar lo exótico la adquirió en su propia casa, en la que había una notable gradación de matices: el padre, blanco; la madre, criolla de República Dominicana; las hermanas, medianamente mestizas.
En el Museo del Louvre (París, Francia) se encuentra la mayor concentración sus obras: 2,200 dibujos, varias decenas de pinturas, 37 álbumes y carnets que fueron donados por el barón Arthur Chassériau, primo de Théodore, hijo de Fréderic Chassériau, arquitecto de los puertos de Marsella y de Argelia, quien era hijo del general barón de Chassériau, muerto en la batalla de Waterloo en 1815, hermano del padre de Théodore, don Bénoit de Chassériau.
Expuso por vez primera en el Salón de París en 1836, obteniendo una medalla de tercer puesto en la categoría de pintura de historia.
A lo largo de su vida fue un prolífico dibujante; sus retratos ejecutados con grafito son de un estilo parecido a los de Ingres. Creó un cuerpo de 29 grabados, incluyendo un grupo de 18 aquafuertes con temas de Otelo de Shakespeare.
Un arte a menudo asociado a un intento de reconciliar el clasicismo de Ingres con el romanticismo del genio Delacroix.
